Bactericidas eficientes em processos industriais

O manejo adequado da assepsia em um processo alcoólico contribui, e muito, para os resultados finais da fermentação. Como quem de fato produz o etanol é a levedura, ter no processo uma cepa de levedura eficiente e dar a elas as melhores condições possíveis é a melhor forma de se obter sucesso na fermentação.

Em um trabalho de Especialização em Biotecnologia da Unoeste (Universidade do Oeste Paulista), a bióloga e microbiologista Angelica Firmino e sua orientadora, a engenheira de Produção Andreia Olivo, desenvolveram um trabalho com o objetivo de entender o comportamento e a resistência de bactérias em relação a agentes químicos (bactericidas) com ação antimicrobiana e concentração determinada pelo fabricante para que ocorra a inibição dos microrganismos.

Os microrganismos, coletados no campo e utilizados para o estudo foram o E. Coli ATCC 8739, o S. aureus ATCC 6538 e oE. coli.

Dessa forma, uma levedura de qualidade, para a produção de etanol suportar e se manter em todo processo fermentativo, durante toda safra, precisa de boas práticas e boa produtividade, aplicando os princípios de boas práticas no processo.

Já no momento em que a matéria cana entra na indústria para ser processada, implantando o primeiro método de assepsia na cana, aparelhos e instrumentos continuam fazendo adições de biocidas naturais ou bactericidas.

A agroindústria do etanol é um grande e considerável gerador econômico do país. Como toda a produção de álcool ocorre por via fermentativa, este processo tem sido constantemente aprimorado.

As infecções bacterianas na fermentação podem causar danos ao processo, tais como: consumo de açúcar, formação de goma, floculação do fermento, inibição de queda da viabilidade das leveduras devido às toxinas e ácidos orgânicos excretados no meio e, por consequência, redução no rendimento e na produtividade da fermentação (ALCARDE; HORII; NOBREI, 2007).

As contaminações bacterianas também se proliferam devido ás condições operacionais da própria indústria como sistema de moagem tratamento térmico, pontos mortos de esmagamento da própria cana, sistema de circulação dos caldos nos tanques.

A assepsia desde primeiro momento do processo da cana é fundamental, para que haja uma redução nos índices bacterianos no processo. Na busca de alternativas que sejam viáveis e eficientes economicamente, gera a utilização de uma substancia de baixo custo, como adição de hidróxido de sódio (NAOH) vem sendo uma medida preventiva satisfatória para uma assepsia dos equipamentos e aparelhos no processo.

Para assegurar uma fermentação alcoólica sem competição de microrganismos, é recomendado o uso de biocidas naturais ou bactericidas.

Os testes de sensibilidade podem ser realizados para por em prova a eficácia do produto aplicado nos caldos em tratamento para o combate de bactérias, sendo possível prever o estado fermentativo.

A fermentação alcoólica em si é obrigatoriamente composta por vários microrganismos que merecem cuidados especiais, e como existe uma variedade muito grande de microrganismos indesejáveis que pode causar infecção no mosto, é de extrema importância a identificação desses agentes para que se efetue com eficiência no seu controle. (JUNIOR; DAMAZO; SANTOS, 2010).

O termo desinfetante é comumente empregado para designar substâncias capazes de destruir.

microrganismos patogênicos não esporulados em curto espaço de tempo, quando aplicado a objetos inanimados. Sanitizantes são desinfetantes que reduzem o número de microrganismos a níveis considerados seguros para a saúde pública.

No entanto, como a grande maioria dos produtos comercializados encontra-se rotulado como “desinfetante”, qualquer germe patogênico que se mostrar resistente ao desinfetante, na maior diluição recomendada pelo fabricante, é motivo de reprovação.

Material e Métodos

A abordagem deste artigo é embasada nos dois métodos utilizados no processo fermentativo alcoólico. O primeiro baseia-se na medida preventiva de assepsia com adição de NaOH. Já o segundo método é embasado na medida preventiva de adição de bactericidas.

O trabalho foi realizado em quatro etapas principais, sendo elas a escolha e avaliação dos componentes químicos (bactericidas) ativos, preparo dos materiais, incubação dos microrganismos, análise e interpretação dos resultados.

Os controles de assepsia e a implantação de uma medida corretiva, que se baseia em teste de sensibilidade para melhor escolha dos bactericidas a serem aplicados.

As pesquisas foram realizadas durante toda safra de 2018 com o intuito de supervisionar as reações de bactericidas aplicados no processo. O acompanhamento foi realizado em uma usina no interior do estado de São Paulo.

O enfoque central de discussão deste trabalho foi analisar a eficiência dos quatros bactericidas adquiridos pela própria empresa, pela sua grande utilização como agente combatente no processo de assepsia.

O teste em laboratório utilizou uma concentração de 200 µl de todos os bactericidas em testes, com as bactérias prescritas nas fichas técnicas do fabricante.

1. Preparo dos Bactericidas

Os bactericidas foram preparados de acordo com as especificações contidas nas fichas técnicas fornecidas pelos fabricantes. Porém, foram submetidos à adição de matéria orgânica.

Para o teste com adição da matéria orgânica utilizou-se a concentração de bactericidas de 200µl. Com matéria orgânica, foi utilizado o caldo mosto com pH de 5,8, adicionando-se 1 ml em cada tubo de bactericida antes do início dos testes.

1. Procedimentos Microbiológicos

O preparo das culturas para as análises microbiológicas foi realizado baseando-se na portaria nº101, de 17 de agosto de 1993 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1993).

O preparo para coloração de Gram foi baseando-se na portaria nº 578, de 8 de dezembro de 1998, instrução normativa nº62, de agosto de 2003 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.

O preparo para as análises microbiológicas em contagem padrão de microrganismos aeróbios estritos e facultativos viáveis mesófilos foram realizados baseando-se na portaria nº101, de 17 de agosto de 1993 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1993).

1. Microrganismos Utilizados

Os microrganismos utilizados para a experimentação foram bactérias gram-positivas e gram-negativas, provenientes de isolamentos em água, com uma linhagem considerada padrão.

As linhagens utilizadas, bem como as características de cada espécie, estão descritas na Tabela 1. Sua escolha é justificada com os testes realizados com as fichas técnicas de cada fabricando.

Tabela1: Características e classificação dos microrganismos utilizados no experimento. As coletas das amostras foram realizadas na área industrial da usina, tanques dos caldos, primário, misto e caldo filtrado que é direcionado para a destilaria, tanque pulmão, e mosto.

Contagem padrão de microrganismos aeróbios estritos e facultativos viáveis mesófilos.

Utilizou-se tubos graduados e esterilizados, tendo dois períodos de coleta, antes da assepsia e após a assepsia com NaOH.

Foi realizado o mesmo procedimento de coleta com adição de bactericidas. Adicionou-se 25 ml de todas as amostras em frascos separadamente e identificado com todas as amostras, contendo 225 ml de água peptonada 1% em todos os frascos.

Procedeu-se a repicagem de todas as amostras em tubos com 9 ml contendo água peptonada 1% obtendo as diluições devidas, (10⁰, 10¹, 10²,10³,10⁴,10⁵,10⁶,10⁷) e plaqueamento em duplicata em petrifilm (Aerobic Count Plate).

As placas foram incubadas a 36 ºC por 48 horas. Após, realizou-se a enumeração das colônias, os resultados foram expressos em log UFC/ml.

Preparo da suspenção de bactéria(s)

Realizou – se um pool de cepas (E. coli ATCC8736, S. aureus ATCC6538 e E. coli isolada em água), a serem utilizadas no teste de eficiência, em tubos contendo 3 ml de caldo infuso de cérebro-coração BHI. Incubou – se 36 ± 2ºC por 18 a 24horas.

Teste de eficiência dos bactericidas frente aos microrganismos

A avaliação de eficácia antibacteriana com o método de diluição, com teste de suspensão. Tubos de ensaio contendo os bactericidas na concentração 200 ppm com matéria orgânica receberam 0,1 ml dos (isolados bacterianos).

Mantendo-se constante a temperatura ambiente, após os tempos de contato 15’, 20’ e 30 min, foi retirada uma alíquota, por meio de alça bacteriológica de platina com 10 µL e colocada em tubos de ensaio contendo 3 ml do meio de cultura caldo BHI e incubados por 96 horas a 36 ± 1ºC.

Após esse período fez- se a leitura observando a presença de turvação, película ou precipitado que indicava o crescimento bacteriano nos tubos.

Medição delta pH.

Foram coletadas amostras de caldo (primário, misto), filtrando-se e transferindo-se 50 ml para um béquer, ajuntando-se o pH para 5,5 (pH inicial, com NaOH (1N) ou H3PO4 (1N)).

Incubou-se a 37°C por 4 horas em banho-maria ou estufa.

Determinou o pH após incubação (pH final). Calculando delta PH = pH inicial – pH final

Resultados e Discussões

A denominação “germicida”, isto é, bactericida, virucida, fungicida, amebicida, podem somente ser aplicado a agentes capazes de destruir os microrganismos.

O fabricante deve especificar quais os germes sensíveis, conforme a tabela 2.

Tabela 2: Classificações e características dos bactericidas, aplicados nos processos industriais de sucroalcooleiro e também em outros setores industriais que visam no monitoramento asséptico, combatendo a multiplicação indesejada de microrganismos em todo processo.

Nas análises de delta pH nos principais caldos, primário e misto, notou-se um uma taxa de multiplicação de bactérias indesejada. Como se pode notar no gráfico 1, no primeiro semestre da safra há um aumento na taxa de multiplicação, implantando análises mais detalhadas para eficiência das amostras dos bactericidas aplicadas no processo.

Grafico1: Determinação das atividades microbianas (produção de ácidos) através dos caldos primário, misto ou mosto, levando a um levantamento das medias do delta pH nos caldos primário e caldo misto e taxa de multiplicação de bactérias no primeiro semestre.

Após vários resultados com números elevados de contaminação nos caldos, o checklist no monitoramento da assepsia na moenda redobrou-se. A adição da solução aquosa de NaOH apresentou uma remoção parcialmente na matéria orgânica nas parede dos tranques e peneiras, evitando a proliferação de microrganismos contaminantes, como toda assepsia primaria no processo, a adição de bactericidas é essencial para alavancar um caldo com baixo índice de infecção bacteriana e diminuição de produção de ácidos, levando uma diminuição na taxa de multiplicação nos caldos.

Grafico2: Através da adição dos bactericidas e uma assepsia adequada, a diminuição da produção de ácidos nos caldos primários e mistos teve uma queda significativa, assim ajudando na diminuição na taxa de multiplicação das bactérias nos caldos, medias do delta ph e taxa de multiplicação de bactérias segundo semestre.

Conforme as análises realizadas nos caldos, a adição dos bactericidas promoveu um declínio satisfatório no grau de infecção bacteriana nos caldos. Com parâmetros satisfatório, as análises de confirmação foram necessárias para dar mais ênfase na necessidade de um bom produto e uma assepsia bem-dotada no processo industrial.

Tabela 3: Media da contagem padrão de microrganismos sem adição de bactericidas e após adição de bactericidas.

Figura1: lâminas 1,2 e 3 colorações de Gram realizada com as colônias das amostras em pesquisas.

Figura2: Teste de eficiência dos bactericidas em contato com as bactérias aplicadas. A determinação para o teste teve os tempos de 15’, 20’ e 30 minutos de acordo com todos os testes dos bactericidas. Apenas a amostra três apresentou sensibilidade com as bactérias testadas.

Conclusão

Os resultados obtidos nas condições em que o presente estudo foi realizado oferecem as seguintes conclusões.

A técnica de cultivo de microrganismo em suspensão, em meio de cultura caldo de infusão cérebro e coração permitiu uma visualização positiva dos microrganismos, mostrando-se viável para realização dos testes de eficiência dos bactericidas em foco.

Os quatros bactericidas analisados apresentaram atividade com os microrganismos satisfatoriamente e adequada.

O desemprenho dos bactericidas, Cloreto de alquil. dimetil benzil amônio, quaternário de amônio e Cloreto de benzalcônio em (contêiner) tiveram um desempenho positivo e satisfatório.

O desempenho da amostra do mesmo bactericida Cloreto de Benzalcônio, porém em armazenamento diferente em (Bário), não teve a eficiência esperada no teste.

Deste modo, concluiu-se que todos os testes e analises realizadas nas amostras são aliadas a implantação do método de assepsia adequada, promovendo uma redução nos índices de contaminação bacterianos e nos pontos de infecção do processo, acrescentando a importância no que diz respeito a eficiência no controle preventivo e pro- ativo de infecção no  processo da produção de etanol.